應同寫意邀請，公司董事長張健存博士在“2022新型生物藥先進技術峰會”上做了《mRNA疫苗和藥物共轉錄加帽技術研究進展》的報告，本文系根據報告內容整理。
? ? ? ?眾所周知，分子生物學的核心理論，是從DNA到RNA、蛋白。而轉錄，就是從DNA生成RNA的過程。
? ? ? ?但是，在細胞核內以DNA模板生成的是premature的RNA，需要在細胞核內進行一系列后轉錄的修飾，生成成熟的mRNA，轉移到細胞質內進行后續的翻譯過程，形成相應的蛋白。
? ? ? ?后轉錄修飾是非常復雜的過程，包括幾種酶的應用。下圖大體描述了這一過程的變化。
? ? ? ?mRNA疫苗和藥物因為具備安全性高、免疫性好、開發周期短以及量產迅速等優勢，已經逐步應用到傳染病疫苗、腫瘤細胞治療、罕見病治療、蛋白代替療法等領域。
1、mRNA的結構
? ? ? ?在真核細胞中，成熟的mRNA具備一些關鍵的結構元件來發揮相關的功能。而體外轉錄的mRNA，則是通過模擬內源性mRNA的結構來發揮作用。
? ? ? ?成熟mRNA的結構主要有五個部分，從5' 到3' 包括：5' 帽子結構（5' cap）、5' 非翻譯區（5' UTR）、編碼抗原的開放閱讀框、3' 非翻譯區（3' UTR）和一個PolyA尾。
? ? ? ?新冠mRNA疫苗快速研發、生產和批準，使世界對mRNA有了更深入的認識。當前有很多研究正在開展，不僅是疫苗、藥物應用上，也涉及各種細胞治療、基因治療方面，驗證著mRNA的潛力。
? ? ? ?而想要實現這些突破，帽子結構（cap）對于mRNA來說至關重要。
? ? ? ?5' 帽子結構包含一個7-甲基鳥苷核苷。現有研究發現，5' 端帽子結構可以調節mRNA的剪切成熟，并幫助RNA轉錄產物穿過核膜的選擇性孔道而進入細胞質。
? ? ? ?此外，5' 帽子結構還可以保護mRNA不被核酸外切酶降解，與翻譯起始因子蛋白協同工作，招募核糖體，并協助核糖體與mRNA結合，使翻譯從AUG開始。
? ? ? ?抗原編碼區兩側的5' UTR、3' UTR和PolyA尾的長度，則可以調節mRNA翻譯和半衰期。
? ? ? ?mRNA疫苗和藥物的開放閱讀框，是實現功能的關鍵組成部分。這部分通過密碼子優化，在不改變蛋白質序列的情況下增加翻譯。在轉錄過程中，該部分加入假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物，這些修飾核苷酸的引入阻止了模式識別受體的識別，確保翻譯過程產生足夠的蛋白質。
? ? ? ?分別來自Moderna和Pfizer/BioNTech的兩款新冠mRNA疫苗，都含有前述的核苷修飾。
2、真核生物mRNA帽子結構
? ? ? ?帽子結構是指在真核生物中轉錄后修飾形成的成熟mRNA在5'端的一個特殊結構，即m7GPPPN結構，又稱為甲基鳥苷帽子。它是在RNA三磷酸酶、mRNA鳥苷酰轉移酶、mRNA（鳥嘌呤-7）甲基轉移酶和mRNA（核苷-2' ）甲基轉移酶催化形成的。
? ? ? ?根據甲基化程度不同，在自然界的mRNA可形成3種類型的帽子：Cap 0、Cap 1和Cap 2。
? ? ? ?鳥苷以5'-5' 焦磷酸鍵與初級轉錄本的5' 端相連。當G第7位碳原子被甲基化形成m7GPPPN時，此時的帽子稱為“Cap 0”，它存在于單細胞中。
? ? ? ?如果轉錄本的第一個核苷酸的2'-O位也甲基化，形成m7GPPPNm，稱為“Cap 1”，除了單細胞生物外，這是一種多數的帽子形式。
? ? ? ?換言之，Cap 0和Cap 1的主要區別，在于第一個核苷酸的2'-O位羥基是否被甲基化。甲基化具有非常重要的活性和功能，可以提高mRNA在體內表達量，同時幫助mRNA逃脫體內免疫系統識別，更好地穩定mRNA結構。
? ? ? ?如果轉錄本的第一、二個核苷酸的2'-O位均甲基化，成為m7G-PPPNmNm，則稱為“Cap2”。10%-15%真核細胞中存在Cap 2，但它的作?在很?程度上尚未得到探索。
? ? ? ?真核生物帽子結構的復雜程度與生物進化程度關系密切。而mRNA想要成為一種大規模的商業化產品，體外轉錄環節尤其關鍵。
? ? ? ?mRNA疫苗或者藥物需要形成Cap 1結構，才能在體內穩定表達。
3、mRNA加帽的方法
? ? ? ?在體外轉錄、制備mRNA有不同的方法，包括酶加帽、共轉錄加帽等。
①、酶加帽
? ? ? ?這種方法最為傳統，通過dsDNA作為底物，經過轉錄形成RNA，再經后續修飾成為mature的RNA。
? ? ? ?這方面有一個發現值得關注。利用牛痘病毒加帽酶（VCE, Vaccinia caping enzyme）和二氧甲基轉移酶（2'O-methyltransferase），可以實現天然未修飾的帽結構。
? ? ? ?這種方法幾乎可以達到100%的加帽率，問題在于，牛痘病毒加帽酶比較昂貴，需要的酶促成本高（T7聚合酶、無機焦磷酸酶、DNA酶I），批量生產成本高。另外，引入了額外的蛋白和S-腺苷甲硫氨酸（SAM），工藝流程繁瑣，需多次純化，增加了QA/QC檢測項。
②、共轉錄加帽
? ? ? ?利用帽類似物直接進行體外轉錄生成帶帽結構的mRNA，工藝流程簡便，迅速提升mRNA疫苗和藥物的產能。
? ? ? ?基于化學合成工藝的發展，帽類似物的結構已經從最開始第一代的mCap逐步發展到第二代的ARCA和第三代Cap 1類似物（CleanCap）。
? ? ? ?第一代帽類似物mCap，標準帽結構類似物由于存在兩個游離的3'-OH部分，m7Gppp G能夠以兩種方向整合m7G（5' ）pppG-RNA或G（5‘）pppm7G-RNA，產生轉錄本為5' -加帽和5' -三磷酸的混合轉錄產物。
? ? ? ?帽類似物以錯誤的方向摻入形成的反向帽結構與eIF4E結合很差，mRNA則無法有效翻譯，從而導致目標蛋白產量低。
? ? ? ?ARCA（抗反向帽類似物）是第二代帽類似物。因為ARCA在第三位進行了甲氧基的修飾，只有一個3'-OH基團，進行共轉錄時為定向整合，因此轉錄過程中只能以正確的方向插入，所形成的mRNA被翻譯時的效率相當于mCap形成的mRNA的兩倍。
? ? ? ?在轉錄反應中，使用ARCA與GTP的4:1混合物將得到約70%的加帽mRNA。ARCA共轉錄生成Cap 0結構的mRNA，1μg起始模板量大約轉錄產生~30μg mRNA產物，轉錄產量低，并且需要二氧甲基轉移酶進一步作用生成Cap1結構的mRNA。
? ? ? ?第三代Cap1類似物（CleanCap）共轉錄直接生成Cap1結構的mRNA，1μg起始模板量大約轉錄產生80-100μg mRNA產量高，加帽效率提高到90%以上。
? ? ? ?第三代方法解決了ARCA產量低和加帽效率低的問題。BioNTech上市的新冠疫苗BNT162b2采用共轉錄加帽工藝。
? ? ? ?不過，由于這種技術涉及高昂的專利費，業界也亟需能夠避開專利實現共轉錄加帽的新方法。需要考量的因素包括：高效轉錄過程具有較高的mRNA加帽率；能被eIF4E復合體識別，轉錄率高；mRNA穩定性好；易于擴大規：統殺拘б嫻。
? ? ? ?迄今為止，也有很多的研究聚焦在帽結構的化學修飾上，通過在帽結構的不同位置進行不同的修飾改造，可以增加mRNA的表達量。
4、k8凱發官網核苷核酸平臺
? ? ? ?k8凱發官網致力于同各國創新，提供高質量、高性能且具有價格優勢的系列核苷核酸原料，積累了30多年的核苷核酸化學經驗和積累，包括修飾核苷合成、核苷三磷酸產業化工藝、核苷phosphoramidites等。
? ? ? ?更重要的是，k8凱發官網推出系列mRNA疫苗和藥物原料，涉及NTPs, PseudoUTP, N1-Me-pseudoU TP, Modified NTPs，以及專利產品ARCA, trinucleotide LZ Caps。
? ? ? ?在產能方面，目前k8凱發官網建立了2200㎡專業GMP-like設施、生產體系和分析質量體系，可以確保多公斤級Batch產能。
? ? ? ?其中一個產品是對標ARCA的dinucleotide cap，表達量比前者更有優勢。
? ? ? ?三核苷加帽原料方面，k8凱發官網的trinucleotide cap LZ Cap對標CleanCap，可以滿足“一鍋法”mRNA制備，比Clean Cap有更高的mRNA產率和蛋白表達量。
? ? ? ?核苷酸原料在mRNA疫苗的原材料成本中占比高達40%以上，是mRNA疫苗和藥物的核心元件，特別是滿足“一鍋法”的三核苷的加帽試劑，例如Clean Cap由于有專利保護，成為制約這一領域發展的“卡脖子”技術。
? ? ? ?k8凱發官網希望通過提供高效、高質量的系列核苷關鍵原料，幫助國內外mRNA疫苗和藥物企業快速推動產品研發。
